鲲羽科普｜多重荧光成像“串色”是怎么回事？原理与解决方案

小鲲：AI救命！我最近做双色免疫荧光，用的Alexa Fluor 555 和 Alexa Fluor 594。结果拍出来两个通道的信号几乎一模一样，共定位系数高得离谱。可我翻了文献，这两个蛋白在我们这个体系里根本没有相互作用的报道。这是怎么回事？

AI：先别急着推翻你的生物学结论，但也先别急着相信它。“两个通道信号一样”通常有三种可能：

•  真的共定位。 两个蛋白确实在同一位置：同一个细胞器、同一个蛋白复合物，或者本来就位于同一片区域。

•  抗体或染料本身的问题。 二抗交叉反应、非特异性吸附、偶联比异常，都会造成“看起来共定位”的假象。

•  串色。 一种染料的荧光“漏”进了另一个染料的检测通道——这是接下来要重点讲的。

根据你的描述，555和594的光谱重叠比较严重，很多显微镜的默认配置难以把它们分开，推测是串色。建议你做以下排查：

1.  做单标对照：只染A、只染B，用完全相同的成像参数各拍一次。如果 A 的单标样本在 B 的通道里也很亮，基本可以锁定串色。

2.  看亮度比例：串色通常表现为“一个通道的图案是另一个通道的“比例缩放”，两个通道的强度图高度相似。

3.  如果两套单标都干干净净，那问题就不在光学上，该去审问抗体。

小鲲：道理我懂了，可分明是两个独立的通道，为什么会出现串色呢？

AI：因为很多人心里想的荧光染料光谱，和它真实的样子，根本不是一回事。你以为的荧光染料的吸收和发射光谱，是一根“线”：

555和594峰位相距30多nm，看起来进水不犯河水，实际的荧光染料的吸收和发射光谱——两座很宽的“山包”：

Alexa Fluor 555 ：

Alexa Fluor 594：

 把它们合在一起：（虚线是激发光谱，实线是发射光谱）

看到了吗？两者的重叠部分很多，这就是串色的根本原因：当显微镜的激发光落在两者激发光谱的重叠区，而检测器的接收波段又落在两者发射光谱的重叠区时，两种染料的信号会被同时检测到，也就是通常所说的串色。

而且不只是这对组合，很多谱峰“看起来离得很远”的荧光组合，实际仍然存在串色风险。如果不懂其中的原理，就可能把假阳性当成真实信号去解读。

小鲲：那如果我想要同时检测更多的靶标，有没有办法在同一张玻片上得到多个通道的准确信息？

AI：当然可以，但需先明白一件事：可见光区里能“互不串色”的荧光窗口就那么几个：DAPI/Hoechst（蓝）、FITC/AF488（绿）、TRITC/Cy3/AF555（黄绿）、Cy5/AF647（远红）。这不是显微镜厂商小气，是光谱物理的限制。

所以 “4 色”并不是硬上限，只是默认配置的上限。想要突破它，你需要在荧光染料和滤光片上做优化：

一、荧光染料优化：选择“山包”更窄、更陡峭的荧光染料，尽量避免与相邻荧光有大面积重叠，少量重叠交给滤光片解决（注意：光谱越窄的染料往往亮度更低，需要权衡）。

二、滤光片优化：选择带宽更窄、带外漏光更少的滤光片。

前面说到的“激发光”和“接收光”，实际都是靠滤光片来“分选”和“截留”的。显微镜的滤光片一般由三个部件构成：

1.激发滤光片（exciter）：只让特定波段的光通过（通常是较短波长的光），决定“用哪段光去照”。

2.二向色镜（dichroic mirror）：45度放置，反射短波（激发滤光片筛选后的激发光）到样本上，再把样本返回的长波发射光透射过去。

3.发射/阻挡滤光片（barrier / emission filter）：只让特定波段的发射光通过（通常是比激发光更长的波段），决定“收哪段光”。

完整的光路通常是：激发光光源 → 激发滤光片 → 二向色镜（反射）→ 物镜 → 样本 → 样本受激发出荧光 → 物镜（收集）→ 二向色镜（透射）→ 发射滤光片 → 探测器。

荧光显微镜光路图

三、定制滤光片，通过荧光通道和滤光片的组合实现多通道的同步检测

设计方法分两种：

1. 防止激发串色：如果目标荧光的激发光谱能与相邻荧光区分开，就把激发滤光片的带通设在目标荧光的激发峰上，避开相邻荧光的激发光谱；

2. 防止发射串色：如果目标荧光的发射光谱能与相邻荧光区分开，就把发射滤光片的带通设在目标荧光的发射峰上，避开相邻荧光的发射光谱；

两条同时满足效果最好，至少要满足其中一条，才谈得上避开串色。需要注意的是，滤光片带通越窄，透过的光越少，荧光信号也会相应变弱；而且窄带滤光片定制复杂，需要提前和厂家沟通能否做出符合需求的滤光片组合。如果你对这个方式感兴趣，不妨去 Fluorescence SpectraViewer 上动手设计一下。

小鲲：染料我也筛了，滤光片我也设计了，通道还是不够用怎么办？

AI：终极方法：光谱成像与光谱拆分，不过，它需要硬件与软件算法的共同升级。

常规显微镜的一个通道 = 一块滤光片 + 一个检测器，它只能告诉你“这一段波长有多亮”。光谱成像（spectral imaging）换了个玩法：把每个像素的发射光色散开，记录成一整条光谱曲线（通常 8–32 个波段）。

然后做数学。事先用单标样本测好每种染料的参考光谱（reference spectrum），假设每个像素的实测光谱是各荧光团参考光谱的线性叠加（来点数学知识）：

S(λ) ≈ Σa_i·R_i(λ)

其中R_i是第i种染料的参考光谱，a_i是它在那个像素里的贡献量。用最小二乘法（通常加非负约束）解出所有a_i，就得到了“拆分”后的各通道图像。

只要各染料的参考光谱形状有足够差异，即使发射峰只差 20–30 nm，也能拆开。这就是光谱拆分能突破 4 通道的原因——它不再依赖滤光片的硬边界，而是利用整条曲线的形状。

使用光谱拆分可以把通道做到十几个，但缺点也比较明显：因为结果完全靠算法解析，光谱上的任何偏差都可能被带进结果。例如不均匀的背景荧光、不稳定的参考光谱、光漂白等，都会引入噪声，影响拆分的准确性。

光谱拆分解析示意图

小鲲：那要求再高点，我想检测几十个靶标怎么办？

AI：以上方案对硬件的要求都比较高，需要特定的显微镜模块或定制滤光片，通量也仍然有限。如果你只是想达成“在一张玻片上检测多个靶标”，我给你一个务实的替代方案：硬件不动，把检测拆成多轮做——一次拍 4 色 → 抹掉信号 → 再拍 4 色 → 如此往复 → 最后把 N 轮图像叠成一个高维数据。这种方式在目前的蛋白和 RNA 检测中都有使用，例如：

l 循环免疫荧光（CycIF）：荧光团用温和的碱 + 双氧水 + 光照灭活，然后重新染色、重新成像。培养细胞可做到约 30 通道，FFPE 组织切片可做到约 60 通道。

l 靶向空间组（MiP-seq）：RNA 先经锁式探针杂交、连接、滚环扩增（RCA），每一轮在滚环产物上杂交带荧光的探针，成像后洗掉，再进入下一轮；可实现对几十个 RNA 靶标的高效、精准检测。

l CODEX：抗体上挂一段 DNA 条形码，每一轮只加一条带荧光的互补寡核苷酸，成像后洗掉、进入下一轮。原始版本验证了 58 个寡核苷酸条形码、46 抗体的 panel；商品化平台的通道数已经上百。

 CsTSA (Cyclic multiplex tyramide signal amplification) 技术的多轮成像原理

AI：总结下今日知识点：

串色不是操作失误，而是荧光染料“宽光谱”带来的固有限制。只要两种染料的激发光谱或发射光谱有重叠，而显微镜的激发波段与检测波段又恰好落在重叠区，串色就会发生——这和你的操作手法无关。

理解了串色的基本原理，就可以对症下药：染料和滤光片的适配，让你在后续实验过程就能提前规避串色风险；光谱拆分技术能满足更高通量的成像需求；至于几十靶标的野心，拿时间换通量的多轮成像或许是你的最优解。

下次再看到共定位系数高得离谱的图，先别急着开心，也别急着崩溃。先做单标对照，让证据说话。

小鲲：懂了。先去做单标对照，谢谢 AI，这就去给 555 和 594 分别做"单独笔录"。