空间转录组项目，真正决定成败的往往不是“上机”本身，而是上机之前：平台选错、样本质量不过关、ROI规划不足，或批次设计失控，都可能让一次高成本实验在后期难以补救。

2025年，Josep Carreras白血病研究所的Daniela Grases与Eduard Porta-Pardo在《Trends in Biotechnology》发表实操指南，复盘Visium、Visium HD和Xenium平台超过1000份样本，总结了从课题设计、组织处理到数据分析的常见失误与可复现原则。

鲲羽生物结合MiP-seq技术实践、空间样本处理经验及团体标准《空间多组学数据采集分析技术规范》（T/CIET 1658-2025），将核心要点整理为6个可直接对照的环节：技术选型、团队配置、实验设计、样本质控、实验执行和数据分析。无论你是在做方案设计、评估样本，还是排查实验失败原因，都可以从对应环节快速定位。

一、技术选型：先回答科学问题，再谈平台

第一步先问：这个课题是否真的需要空间信息？平台不是越“高配”越好，分辨率、基因通量与样本兼容性都应服务于生物学问题。

1. 判断空间信息的必要性：若研究涉及细胞互作、肿瘤微环境、空间梯度表达等空间依赖型问题，空间转录组学不可或缺；但仅需整体表达差异则优先选择bulk RNA-seq或单细胞转录组测序。

2. 匹配空间分辨率：当需要单细胞/亚细胞分辨率以解析免疫突触、精细细胞状态等微观结构，可选Xenium、CosMx、MERFISH、MiP-seq等高分辨率靶向平台；若仅需了解组织区域、梯度模式的整体概览，可选择Visium点阵平台。

3. 基因覆盖范围：全新探索性无偏筛选研究选全转录组平台；假设驱动的研究选靶向成像平台，以避免大panel对关键信号的稀释。

4. 核心权衡原则：分辨率、基因通量、平台兼容性三者综合统筹，所有取舍均服务于研究问题的生物学目标。

二、团队协作：实验、病理、生信缺一不可

空间转录组是一项高度跨学科的工作。实验、病理和生信团队如果未在项目启动前共同制定方案，问题往往会在样本消耗后才暴露。

1. 专职实验人员-样品制备和实验执行：承担精准切片、RNA保存、透化/杂交/成像等标准化操作，严控切片厚度、温度、孵育时间等细节，保障实验一致性与可重复性。

2. 病理学专家-组织学评估与质量控制：评估组织质量、识别肿瘤边界等关键区域、排除坏死区域/伪影、规范多样本ROI界定，临床样本研究的可靠性，均高度依赖专业的病理学判断。

3. 生物信息分析师-数据处理与整合解读：完成数据预处理、空间标准化、聚类、细胞解卷积（如RCTD/cell2location）、批次效应校正及多组学整合，将原始数据转化为可解释的生物学结论。

关键原则：项目启动时全员参与，提前明确职责并保持持续沟通，从源头降低样本浪费与数据失效风险。

三、实验设计：重复、ROI与批次控制必须前置

切片选取、ROI界定和样本分组都会影响最终结论。与其事后“救数据”，不如在实验开始前控制三类偏差：

1. 样本重复与ROI规划：依托预实验进行功效分析，确保合理生物学重复数与ROI数量，杜绝因样本/区域不足导致结论偏倚。

2. 全切片 vs. 组织微阵列（TMA）：TMA适合多样本并行，成本和批次控制更有优势，但捕获面积有限，且文献报道存在15%-33%的芯块脱落风险；全切片可保留连续空间结构，更适合需要完整组织背景的机制研究。是否采用TMA，应结合队列规模、目标区域异质性和预算综合判断。

3. 批次效应管控：预防远优于事后修正。规范实验流程、随机分配样本位置、统一处理条件，必要时搭配Harmony、Seurat等工具校正，但需避免过度校正掩盖真实生物差异。

4. 对照设置：设置阴性/阳性对照，保障实验结果可信度。

四、样本质控：RNA质量与组织形态双把关

样本质量是最难在后期补救的变量。建议同时评估RNA完整性和组织形态，不能只看单一指标。

先看平台阈值，再做补充质控

1. 两种主流样本体系规范

• OCT新鲜冷冻：RNA完整性通常较好；常用切片厚度约10 μm，Visium常建议RIN≥7。应在低温下快速包埋，减少冰晶造成的组织损伤。

• FFPE石蜡：便于长期保存，常用切片厚度约5 μm。不同Visium流程的推荐阈值并不完全相同，应以所选平台最新手册为准；例如Visium CytAssist/Visium HD通常建议DV200≥30%。

• DV200略低于推荐阈值并不必然意味着数据不可用，但失败风险和灵敏度损失可能增加，建议先做小规模预实验，再决定是否投入完整实验。

除RIN/DV200外，鲲羽生物建议增加内参基因预实验质控：用GAPDH、ACTB等管家基因开展小规模RNA FISH，可从信号强度、背景和组织形态等维度补充判断样本是否适合后续实验。该方法用于补充，而不是替代RIN/DV200。

（更多细节可参阅《经验宝典｜避坑必看！你的样本能做空间转录组吗？——空间转录组样本“取材-切片-保存-质控”全流程攻略》）

2. 形态双质控：建议对相邻切片进行H&E染色；成像类平台可增加DAPI核染色预筛，用于评估组织完整性、定位目标区域并排除坏死区域。

3. 特殊组织处理：

脂肪组织：低温切片，厚度＞12μm；

骨/钙化组织：EDTA温和脱钙，防止组织碎裂、脱片；

4. 鲲羽生物基于样本处理经验，建议结合组织类型和研究目的选择包埋方式：脑、眼球、肠、类器官可优先评估冷冻包埋；心脏、肾脏、肺、皮肤可优先评估石蜡包埋。最终方案仍需结合组织特性和下游平台确定。

（更多细节可参阅《鲲羽科普|RNA-FISH组织特异性包埋方式选择》）

五、实验执行：把关键变量锁进标准流程

1. 试剂与耗材：全程 RNase-free 管控、新鲜试剂、统一批号，严控有效期与储存温度；

2. 操作规范：严格遵循平台方案，不随意调整试剂量、孵育时间与温度；

3. 样本处理：使用洁净器械和新鲜刀片，切片前应修剪1-2片以去除表面污染组织，并为每类样本准备备份块；

4. ROI：提前用H&E/IHC界定ROI，或快速实时染色以辅助定位，小型ROI可采用切割重包埋方式，适用于构建组织微阵列（TMA）；

5. 实时分段质控：RNA完整性、组织形态、预杂交荧光，逐级淘汰不合格样本，避免后端耗材浪费。

六、数据分析：校正要有度，结论要可复现

1. 空间数据同时包含基因表达与位置信息。分析目标不是“做出漂亮的图”，而是保证元数据完整、处理流程透明、结果可复现。

2. 质控与标准化：过滤低质量UMI/低表达基因，用对数归一化、SCTransform校正测序深度差异；

3. 核心分析：测序类平台通常需要通过细胞类型解卷积解析混合信号；成像类平台则需要完成信号解码，并将转录本分配到对应细胞。

4. 批次校准：多样本、跨平台数据易存在批次偏移，校正需控制力度，避免掩盖真实生物学差异；

5. 平台适配：测序类平台适合全转录组探索，成像平台适合高分辨率靶向研究，须依据研究目标权衡选择，并关注算法基准测试研究，以优选分析工具。

项目启动前，先回答三个问题：

①研究真正需要哪一级空间分辨率？

②样本能否通过RNA与形态双质控？

③实验、病理和生信团队是否已经共同完成方案设计？

越早通过预实验和技术路线评估回答这些问题，后续试错成本越低。鲲羽生物可围绕样本评估、靶向panel设计、MiP-seq实验与数据分析提供支持。你在空间转录组项目中最常卡在哪个环节？欢迎留言交流。

参考资料

1. Grases D, Porta-Pardo E. A practical guide to spatial transcriptomics: lessons from over 1000 samples. Trends in Biotechnology. 2025. doi:10.1016/j.tibtech.2025.08.020；PMID:40975650。

2. 《空间多组学数据采集分析技术规范》（T/CIET 1658-2025）。