目前空间组学技术主要应用于5-20微米的薄组织切片，只能将原本立体的组织截取部分薄片来观察，丢失大量三维结构信息。而近年发展起来的3D厚组织技术能够尽可能保持组织三维结构的前提下，对几十到几百微米厚的样本进行高通量、高分辨率的解析，让科学家在更接近生理结构和状态的环境中研究基因表达和细胞间相互作用，有望对二维的空间组学技术实现三维升级。

脑组织作为细胞异质性最高的组织类型之一，其细胞功能的发挥与位置以及细胞间的相互交流息息相关。当前，对于脑组织的3D厚组织空间单细胞转录组学正在被逐渐建立与应用，对于空间图谱的研究也正从“描绘图谱”迈向“应用图谱”。小编在此主要基于目前两大主流技术路线，介绍3D空间组学在脑组织三维空间图谱绘制的应用，共同推动我们从二维平面视角迈向三维全景，在真实的组织结构与微环境中理解大脑的细胞类型、空间分布与功能。

路线一：基于连续切片的3D重构

本研究利用Stereo-seq空转技术通过对连续二维切片进行高通量测序，再经计算将数据重建成三维图谱以此来实现3D空间转录组效果，优势在于可实现超大视野（如全脑范围）的基因表达空间分析。

图1 小鼠全脑单细胞分辨率空间转录组图谱示意图

研究人员利用Stereo-seq技术，结合单核RNA测序，对123张小鼠脑冠状切片进行测序和3D重构，绘制了覆盖全脑的“分子地图”。图谱包含超过420万个具有空间定位的细胞，覆盖近3万个基因，并鉴定出308个转录组定义的细胞簇。

图2 Stereo-seq空间组学技术思路

基于这一图谱，研究取得多项重要发现：

优化脑区划分：基于全基因组的转录特征，对传统解剖学定义的脑区进行系统性评估，识别出多个具有显著转录组特征的精细功能亚区。

揭示疾病相关细胞的空间分布：在抑郁症研究中，发现下边缘皮层（ILA）的深层谷氨酸能神经元与多种抑郁症相关基因高度相关；在帕金森病研究中，于中脑黑质（Substantia Nigra）区域鉴定出一类特定的多巴胺能神经元亚群，其帕金森病风险基因富集水平更高。

绘制发育动态图谱：覆盖从胚胎（E12.5）至成年（P77）的7个关键发育阶段，揭示了411个具有显著时空动态变化的转录因子调控网络，以及513个脑区特异性的长链非编码RNA（lncRNA）。

该图谱数据已公开上线，支持按脑区、基因、细胞类型进行多维查询与可视化。

理论上，三维结构可以通过连续薄切片来模拟重构，但实际上由于切片过程中不可避免组织变形，使得准确确定细胞在组织内的三维原始形态和组织结构更具挑战性。

路线二：基于厚组织的原位检测技术

该技术路线侧重于在同一块厚组织内进行高分辨率、多轮次成像，以获取基因表达的真实3D坐标，尤其适合深度功能与形态分析。

1、3D MERFISH (Multiplexed Error-Robust FISH)

将MERFISH与共聚焦显微镜的光学切片能力相结合，并引入深度学习提升成像速度和信噪比，成功将应用范围从传统的10微米薄片拓展至200微米厚的脑组织。在小鼠大脑皮层与下丘脑中，实现了对242个基因在厚组织中的3D单细胞转录组成像，为研究深层脑区的细胞类型和空间组织提供了有力工具。

图3 三维厚组织 MERFISH 技术对小鼠大脑皮层和下丘脑细胞类型的空间组织的研究

2. Deep-STARmap / Deep-RIBOmap

通过可扩展探针合成和水凝胶嵌入等技术，实现了对60-200微米厚组织块中数千个基因的转录本及其翻译活性的3D原位定量。该技术的首次应用即是与多色荧光蛋白成像结合，在小鼠脑中实现了单细胞水平的分子分型与3D神经元形态追踪的同步分析，将神经元的分子身份与其三维结构直接关联。

图4 探针合成与水凝胶嵌入技术

图5 3D神经元形态的表征

从连续切片测序重构到厚组织原位成像，两种技术路线各有侧重、互为补充。前者适合全脑尺度的分子图谱绘制与初步探索，后者适用局部脑区的真实结构洞察与深度功能解析。随着技术不断成熟，我们有望在真实三维环境中，逐步解开最复杂的“三磅宇宙”--大脑中的细胞组织规律与分子空间图谱，为我们进一步了解大脑的奥秘提供真实、多维、全景的细胞分子基础。

参考文献：

Han L, et al., Single-cell spatial transcriptomic atlas of the whole mouse brain. Neuron. 2025.

Rongxin F, et al., Three-dimensional single-cell transcriptome imaging of thick tissues. eLife. 2024.

Sui X, et al., Scalable spatial single-cell transcriptomics and translatomics in 3D thick tissue blocks. Nat Methods. 2025.